細胞名稱：HCT-15/5FU 人結直腸癌氟尿嘧啶耐藥株

貨號：WS-h073（STR（HCT15）鑒定）

規格：1×10?cells/T25培養瓶

一、細胞特性

HCT-15/FU為由HCT-15細胞構建的耐5-FU藥物細胞株。

1、來源：人結腸癌細胞耐藥篩選

2、形態：上皮細胞樣，貼壁生長

3、培養基及培養凍存條件準備：

1）5-FU藥物的配制及保存

建議將5-FU藥物配制成20mg/mL的母液，即使用1mL 1M的NaOH溶液溶解20mg 5-FU藥物，使其完全溶解。（若所購買的5-FU藥物規格為10mg，則加入0.5mL 1M的NaOH溶液，待其完全溶解即為20mg/mL母液）

注意：可根據用量配置藥物，并將藥物分裝保存，避免反復凍融導致藥物失效。溶解后的5-FU，4℃保存1周，-20℃保存1個月，-80℃保存6個月。

2）凍存液的配制

90%優質胎牛血清+10%DMSO，現用現配。（凍存液中不含藥物）

3）完全培養基的配制

細胞培養條件

氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養箱濕度為70%~80%。

二、注意事項

1. 收到細胞后，若發現培養瓶破損、漏液及細胞有污染；或凍存管有破損，融化、漏液等，請立即拍照并聯系我們。照片包括細胞培養瓶/凍存管外觀，顯微鏡下細胞照片（100倍，200倍各2張）；

2. 若收到的復蘇細胞有少量細胞脫落、飄起，可能由于運輸途中導致。請先于37℃恒溫細胞培養箱中靜置2~3h后，再進行處理；

3. 復蘇細胞的充液培養基為不含藥物的維持培養基，血清濃度較低，收到細胞后請及時更換為完全培養基；

4. 建議收到細胞后，首先進行擴增（至少3代），并凍存部分細胞以備用。

5. 初次培養，當細胞匯合度達約80%時，可加入10~16ug/mL 5-FU的完全培養基培養至細胞完全融合后傳代。細胞傳代1~2次后仍能保持增殖，即可提高藥物濃度至20ug/mL繼續培養；若此過程中細胞停止增殖，且狀態較差，則需降低藥物濃度（首次降低一半藥物濃度）或使用不含藥物的完全培養基培養，至細胞匯合度達80%左右，且生長狀態較好時，再更換為所需的5-FU藥物濃度。

6. 細胞凍存過程中，不可添加藥物，且凍存液中不含藥物。

三、細胞處理

1）凍存細胞的復蘇

將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4~6mL完全培養基的離心管中混合均勻，1000rpm/min離心3~5min，棄去上清液。加入1mL完全培養基重懸細胞后，均勻鋪于含6~8mL完全培養基的培養瓶（或皿）中，置于37℃恒溫細胞培養箱中過夜培養。第二天顯微鏡下觀察細胞生長情況和細胞密度。

注意：①細胞復蘇過程中，不可使用含有藥物的培養基。須在細胞生長至匯合度達80%左右時，方可添加10~16ug/mL 5-FU藥物；若細胞生長狀態較為緩慢，可適當降低5-FU的濃度（首次降低一半藥物濃度），或使用不含5-FU的完全培養基培養至細胞生長狀態較好時，再更換為所需的5-FU濃度。

②建議復蘇細胞時始終使用防護手套、衣服和戴上防護面罩，避免凍存管處于溫差較大情況下發生爆炸，造成人員傷害。

2）細胞傳代（建議以同等底面積的培養瓶/皿按照1：2比例傳代）

①待細胞密度達到80%~90%時，即可進行傳代培養。

②棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1次，吸凈殘余的PBS。

③加入0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養箱中消化2~5min，顯微鏡下觀察細胞細胞大部分變圓并脫落，即可輕拍培養瓶至細胞全部脫落。迅速拿回操作臺，加入2倍體積的、含10%FBS的培養基中止消化。 

④將細胞懸液移入離心管中，1000rpm/min離心5min，棄去上清液。

⑤向細胞沉淀中加入1~2mL完全培養基重懸細胞，輕吹混勻。將細胞懸液按1：1的比例均勻鋪于2個新的培養瓶/皿中，添加6~8mL完全培養基。

注意：細胞傳代1~2次后仍能保持增殖，即可提高藥物濃度至20ug/mL繼續培養；若此過程中細胞停止增殖，且狀態較差，則需降低藥物濃度（首次降低一半藥物濃度）或使用不含藥物的完全培養基培養，至細胞匯合度約80%，且生長狀態較好時，再更換為所需的5-FU藥物濃度。

3）細胞凍存

①細胞凍存時，步驟同2）細胞傳代的①~④，細胞計數后，加入配制好的細胞凍存液，重懸細胞，按照1×10^6 ~ 1×107個細胞/mL分配到一個凍存管中，標注好名稱、代數、日期等信息。

注意：細胞凍存過程中，不可添加藥物。

②將要凍存的細胞置于程序降溫盒中，-80℃冰箱中過夜，之后轉入液氮容器中儲存。同時記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續查閱和使用。